快速無菌檢測儀在生物制藥領(lǐng)域的發(fā)展與應(yīng)用

 近年來，隨著一些創(chuàng)新藥物的出現(xiàn)，經(jīng)典方法已不能很好地適應(yīng)新形勢新情況。CAR-T 細(xì)胞為近年來創(chuàng)新藥物中的明星品種，是一種特異性細(xì)胞免疫治療，將患者自體T 細(xì)胞通過基因修飾加上腫瘤特異性的嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)，使得被修飾的T細(xì)胞能夠靶向識別腫瘤細(xì)胞并對其進(jìn)行攻擊，從而起到治療目的。

與傳統(tǒng)無菌生物制品相比，CAR-T 細(xì)胞制品在質(zhì)量屬性和無菌生產(chǎn)工藝上存在諸多特殊性，其個體差異大、產(chǎn)量少、效期短、臨床需求緊迫，終產(chǎn)品需要快速放行；而在生產(chǎn)過程中，因細(xì)胞本身無法過濾除菌，無菌生產(chǎn)工藝要求更高，對過程控制要求也更高。在這類創(chuàng)新藥物工藝的近實(shí)時控制和成品快速放行中，耗時的傳統(tǒng)質(zhì)控方法顯然已不適用，需尋求快速、微量的新方法。這些新方法不少是源自基礎(chǔ)科研、臨床等領(lǐng)域，最初并非按制藥業(yè)的要求開發(fā)，因此需要經(jīng)過評價驗(yàn)證，證明其性能不劣于藥典法定方法后，才能用于創(chuàng)新藥物的質(zhì)量控制。

無菌檢測是產(chǎn)品質(zhì)量是細(xì)胞治療等領(lǐng)域保證的關(guān)鍵檢測項(xiàng)目。基于中國藥典的無菌檢查法需要?dú)v經(jīng)14天，并且培養(yǎng)期間需要逐日觀察，經(jīng)過肉眼判讀后記錄結(jié)果。具有周期長、手工環(huán)節(jié)多、人為因素影響大、數(shù)據(jù)完整性欠缺等不足。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，藥品或治療產(chǎn)品的種類也逐漸豐富起來，尤以短效期藥品和細(xì)胞治療產(chǎn)品的出現(xiàn)，將無菌檢測的時間和準(zhǔn)確性提高到了一個新的高度，伴隨著藥品記錄與數(shù)據(jù)管理規(guī)范的加強(qiáng)，數(shù)據(jù)完整性也成為不可忽視的一個問題，這些問題的出現(xiàn)給質(zhì)量控制部門帶來了新的挑戰(zhàn)。

2010 年后，各國藥典針對微生物檢驗(yàn)替代方法的評價和驗(yàn)證推出了一系列指導(dǎo)原則，但在傳統(tǒng)制藥領(lǐng)域，快速替代方法的探索實(shí)例相對較少，而實(shí)際應(yīng)用于上市產(chǎn)品的案例目前更屬罕見，業(yè)內(nèi)經(jīng)驗(yàn)積累較少；但隨著創(chuàng)新藥品上市，這些快速替代方法將會得到廣泛應(yīng)用。

藥品無菌檢查是藥品質(zhì)量中對微生物*的最高要求，任何微生物的存活對于用藥者而言都可能是致命的。近年來屢屢曝出的藥害事件也使無菌制劑的無菌保障問題成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。藥典(1953 年版)就收載了無菌檢查法，在以后的歷次藥典改版中，對培養(yǎng)基種類及質(zhì)量要求、樣品的分類及檢驗(yàn)量、檢驗(yàn)方法等均進(jìn)行了不斷改進(jìn)。目前，無菌檢查法仍采用逐日觀察，培養(yǎng)14 d。根據(jù)培養(yǎng)管渾濁產(chǎn)生的情況判定樣品是否合格，在執(zhí)行過程中存在一些問題，如逐日觀察的規(guī)定會導(dǎo)致無法及時發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，無菌檢查的檢驗(yàn)結(jié)果均為實(shí)驗(yàn)人員手工記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏一定的可追溯性等。當(dāng)前，商品化的快速微生物檢查法(RMM)以其快速、操作簡便、準(zhǔn)確和檢測結(jié)果的可追溯等優(yōu)點(diǎn)，充分滿足了質(zhì)量保證所提出的更高要求，同時，也為過程分析技術(shù)(PAT)的實(shí)現(xiàn)提供了技術(shù)上的支撐。

為了適應(yīng)技術(shù)發(fā)展的需要，中國藥典也于2010年版在指導(dǎo)原則中收載了替代方法驗(yàn)證的有關(guān)內(nèi)容。相關(guān)的規(guī)范性文件的出臺為快速微生物檢查法的評價提供了理論依據(jù)和指南支持。

符合中國藥典中無菌檢測替代方法：【9201 藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則】

解決問題

1.  自動化每10分鐘檢測一次，24小時連續(xù)監(jiān)測

2.  90%陽性標(biāo)本可在12小時內(nèi)被檢測

3.  99%的陽性標(biāo)本可在36小時內(nèi)可檢測

4.  平均檢出時間小于10小時

5.  假陽性率小于0.1%

6. 由傳統(tǒng)的14天降低到4天

7. 一個CFU的微生物可以被檢測出

9201 藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則有以下4個方面。

目前有兩家快速無菌檢測系統(tǒng)已經(jīng)被FDA 批準(zhǔn)用于細(xì)胞治療藥物以及基因治療藥物。在國內(nèi)，該系統(tǒng)也被用于是否為商業(yè)無菌產(chǎn)品的檢驗(yàn)，全血及成分血的無菌試驗(yàn)[，以及臨床血液、無菌體液的病原學(xué)診斷參照中國藥典2010 版附錄藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的有關(guān)內(nèi)容，分別考察專屬性、檢測限、重復(fù)性以及耐用性這4 個方面與現(xiàn)行版中國藥典無菌檢查法相比是否存在差異。

評價對于單一品種無菌檢查采用快速無菌檢測系統(tǒng)替代藥典無菌檢查法的可行性，為該方法作為產(chǎn)品放行檢驗(yàn)和過程控制的技術(shù)手段提供依據(jù)。藥典方法和替代方法實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格厭氧環(huán)境的原理是不同的，前者是通過化學(xué)手段，而后者是物理手段。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，對于嚴(yán)格厭氧菌的檢查，替代方法在操作過程中需要保證操作環(huán)境的嚴(yán)格厭氧。實(shí)驗(yàn)考察了替代方法在2 種操作環(huán)境下(普通生物安全環(huán)境和嚴(yán)格厭氧環(huán)境)，生孢梭菌的專屬性試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果表明，就培養(yǎng)體系促生長試驗(yàn)來看，操作環(huán)境是否嚴(yán)格厭氧對于測定結(jié)果沒有影響，但對于樣品存在的專屬性試驗(yàn)結(jié)果影響則十分顯著。分析原因，由于樣品存在的專屬性試驗(yàn)需要接種10 mL的樣品，在普通操作環(huán)境下導(dǎo)入的氧氣量會明顯增多，由于操作環(huán)境沒有隔絕氧氣，對試驗(yàn)結(jié)果的影響就會凸顯出來，而當(dāng)接種量較少時，比如培養(yǎng)體系促生長試驗(yàn)，這種影響就會被弱化。因此，在進(jìn)行樣品檢測時，需在厭氧的環(huán)境下接種樣品至厭氧瓶，保證嚴(yán)格厭氧菌能被有效檢出。驗(yàn)證結(jié)果表明，替代方法與藥典方法基本相當(dāng)。但是驗(yàn)證試驗(yàn)不可能覆蓋所有的微生物，由于2 種方法的培養(yǎng)基體系不*相同，因此不能排除對于某些微生物的促生長能力2 種方法可能不相當(dāng)。

BD BACTEC FX40 儀器是一種用于檢測臨床樣本中是否存在微生物的自動系統(tǒng)。已植入的瓶放在儀器瓶位中。門關(guān)閉后，將通過瓶中專門設(shè)計(jì)的傳感器測量熒光水平，從而監(jiān)控瓶中微生物代謝活動隨時間的變化情況。此操作由測量子系統(tǒng)執(zhí)行。算法子系統(tǒng)分析測量子系統(tǒng)發(fā)出的信號以確定是否存在微生物生長（即陽性）證據(jù)。攪拌操作由支持有機(jī)體生長的攪拌子系統(tǒng)執(zhí)行。數(shù)據(jù)存儲和檢查通過數(shù)據(jù)管理子系統(tǒng)進(jìn)行管理。如果發(fā)生孵化失敗、攪拌故障或測量系統(tǒng)故障等警報條件，瓶位將顯示為不可用。

用戶界面子系統(tǒng)包括與儀器工作流程有關(guān)的所有儀器功能：首先將瓶插入到儀器中進(jìn)行測試、然后移除陽性瓶，最后移除陰性瓶。可以向系統(tǒng)中輸入統(tǒng)計(jì)信息并以報告形式輸出?？梢酝ㄟ^專為單手操作而設(shè)計(jì)的條形碼閱讀器輸入瓶信息，也可以通過屏幕鍵盤手動輸入。通過在對瓶進(jìn)行掃描后立即將該瓶插入到瓶位，可以將瓶與特定的瓶位相關(guān)聯(lián)；這會激活瓶位的瓶駐留傳感器。您可以查看由儀器處理的瓶的相關(guān)信息、請求打印報告或與 EpiCenter 系統(tǒng)通信。儀器前面的 LED 指示燈和每個瓶位上方的其他指示燈可傳遞狀況信息。每個工作流程事務(wù)完成時，儀器會提供確認(rèn)性的音頻和視頻反饋。

可以將 1 至 4 個 BACTEC FX40 儀器連接到單個平板電腦上，并可以共享一臺打印機(jī)和條形碼閱讀器。此群集可以連接到一個 BD EpiCenter 系統(tǒng)以形成一個在 BACTEC FX40 群集和 BACTEC FX 儀器之間具有*連接的更大安裝。

快速無菌檢測系統(tǒng)采用簡單轉(zhuǎn)接、連續(xù)震蕩孵育檢測技術(shù)，降低了無菌操作污染的風(fēng)險，實(shí)現(xiàn)了檢測結(jié)果及時反饋，區(qū)別于傳統(tǒng)無菌檢查的繁瑣操作、靜態(tài)培養(yǎng)以及人為的濁度判讀法，有其結(jié)果報告的實(shí)時性、可追溯性以及避免人員干擾的優(yōu)勢。

替代方法和藥典方法無菌檢查都是基于培養(yǎng)的，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否為“無菌生長"在一定程度是基于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的培養(yǎng)天數(shù)，也就是說14 d“無菌生長"并不一定意味著15 d 仍是“無菌生長"。因此，縮短無菌檢查的培養(yǎng)天數(shù)是有風(fēng)險的。通過替代方法的驗(yàn)證試驗(yàn)，可以認(rèn)為快速無菌檢測系統(tǒng)作為某一具體品種用于過程控制是可行的。

參照 2015 年及 2020 年版中國藥典四部通則<9201>藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的有關(guān)內(nèi)容，對 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)與中國藥典的無菌檢查法進(jìn)行了系統(tǒng)比較。同時選取特定品種，全面評估 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)與中國藥典的無菌檢查法在專屬性、檢測限、重復(fù)性以及耐用性是否存在差異。為該品種是否能采用 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)進(jìn)行無菌快速檢測提供依據(jù)。

注：文章摘自當(dāng)前發(fā)布的文獻(xiàn)，歡迎咨詢。